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黄芩苷和黄芩素在大鼠体内药动学受肠道菌群失调影响
作者:刘玲  转载自:中草药  发布日期:2018-05-20


黄芩苷与其苷元黄芩素是黄芩的主要有效成分,具有抗菌、抗炎、抗HIV病毒、扩张血管、清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、降压和利尿等多种药理作用[-6,是含黄芩制剂的主要质量控制指标。有文献报道,黄芩苷是复原型前体药物,口服后并不完全直接被吸收,大部分在肠内经肠道菌群作用转化为苷元黄芩素而被吸收入血,再在体内迅速地转化为黄芩苷。因此,在黄芩苷及其苷元黄芩素的体内吸收、代谢过程中,肠道菌群有着重要的作用,甚至影响药效的发挥[7-13]。抗生素类药物能影响细菌的增殖,引起肠道菌群的改变,可能会影响黄芩苷及其苷元黄芩素在肠道中的吸收代谢乃至药效2。然而,与此有关的文献报道很少,因此,本实验采用抗生素诱导大鼠肠道菌群失调,研究在肠道菌群失调条件下黄芩苷和黄芩素在大鼠体内的药动学特征。长期使用抗生素后,对抗生素敏感的正常肠道菌群是否失调可以通过平板活菌计数法判定。该方法计数的线性范围大,能较好地反映菌落的疏密程度,重复性、平行性亦好4。因此,本实验选择用抗生素盐酸林可霉素制备肠道菌群失调模型(平板活菌计数法判定),研究等摩尔剂量(370 umol/kg) 的黄芩苷和黄芩素在模型大鼠与正常大鼠体内的药动学行为差115-161。


材料1.1  仪器 TSQ QUANTUM型三重四级杆串联质谱仪;Thermo MLtiMate 3000型超高效液相色谱仪;LDQUAN数据处理系统; Allegra 型Beckman超速冷冻离心机; VXRB S25型IKA VIBRAX basic自动涡旋振荡仪; SG8200H 型超声波清洗器; 2XZ-1型旋片式真空泵;AB104-N Mettler 型电子天平;立式压力蒸汽灭菌器; BBS-V800超净工作台; DNP-9052电热恒温培养箱。


1.2  药品与试剂 盐酸林可霉素注射液(规格2mL,0.6g),批号1503252;对照品黄芩苷(HPLC测定质量分数>98%,批号110715-201312)、 黄芩素(HPLC 测定质量分数>98%,批号110715-201214)、 染料木素(HPLC测定质量分数>98%,批号110714-201216)均购于中国食品药品检定研究院;麦康凯培养基、肠球菌琼脂培养基、双歧杆菌培养基、乳酸杆菌琼脂培养基、平板计数琼脂,均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;娃哈哈纯净水。


1.3  动物 健康雄性SD大鼠,  体质量(220士20) g,重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供,许可证号SCXK渝2007-0005。


2 方法与结果


2.1  肠道菌群失调模型的制备及评价


2.1.1  肠道菌群失调模型的制备  SD大鼠随机分为抗生素组和对照组,每组6只。抗生素组大鼠ig盐酸林可霉素4mL,每天1次;对照组大鼠ig等体积的生理盐水,连续造模5d。观察大鼠形态、行为变化及体质量变化差异。第6天无菌取大鼠盲肠内容物0.1 g,加生理盐水0.9 mL,涡旋震荡使均质化,进行10倍系列稀释至1X10,选择3个不同稀释度,自高至低在相应的培养基上接种100 pL稀释液标本,放入37“C电热恒温培养箱中进行培养。其中双歧杆菌培养基和乳酸杆菌琼脂培养基厌氧培养48~72 h,其余培养基需氧培养24~48 h。待菌落长出后,观察其形态特征,计数菌落数,并计算每克盲肠内容物中的细菌数量,单位为CFU/g。菌落数量=XX接种体积X稀释倍数/标本质量X是同一稀释度的平均菌落数。


2.1.2 大鼠形态、体质量变化结果  对照组大鼠行动活跃,被毛光滑平整,饮食正常;抗生素组大鼠精神萎靡,畏寒扎堆,畏光,有钻窝现象,被毛无光滑不平整,饮食量显著下降,大便稀湿等。抗生素组实验前后体质量变化与对照组比较,差异不显著(P>0.05)。


2.1.3  肠道菌群检测结果  由肠道菌群检测结果(表l)得知,与对照组比较,抗生素组大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌与总菌群均减少,差异显著(P<0.05)。表明盐酸林可霉素能造成正常大鼠肠道菌群失调。


2.2  给药与样品采集 24只SD大鼠随机分为抗生素十黄芩苷组、抗生素+黄芩素组和黄芩苷组、黄芩素组,每组6只。抗生素+黄芩苷组和抗生素十黄芩素组用“2.1.1”项方法在造模后第6天分别ig给予等摩尔剂量(370pumol/kg)的黄芩苷和黄芩素。黄芩苷组和黄芩素组ig等量生理盐水5d,第6天分别ig给予等摩尔剂量(370 pumol/kg)的黄芩苷和黄芩素。分别于给药后0.5、1、2、4、6、7、8、9、10、12、16、20h经尾静脉取血0.5mL于肝素化离心管中,4000 r/min离心10min,分离上层血浆,保存于-20 "C的冰箱,待测。


2.3  大鼠血浆样品中黄芩苷、黄芩素的定量测定


2.3.1  色谱条件  色谱柱为Thermo DimHypersilGOLD柱(100 mmX2.1 mm,  1.9 pum); 流动相为乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱: 0~8min, 10%-80%A; 8min, 80%-10%A;体积流量0.3 mL/min; 柱温30 C;进样体积10pL。


2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI);检测方式为正离子检测方式;碰撞气氩气(Ar);辅助气氮气(N2);源电压4kV;毛细管电压3.5kV;毛细管温度270 C;蒸发温度300 C。采用一级全扫描质谱(Full scan MS)和选择反应监测模式(SRM)同时测定;  用于定量分析的离子反应分别是m/z447-271 (黄芩苷),m/z271-169 (染料木素,  内标),m/z271-123 (黄芩素)。


2.3.3 对照品溶液和内标溶液的配制 精密称取黄芩苷、黄芩素对照品适量,用色谱甲醇配成含黄芩苷1.055mg/mL、黄芩素1.279 mg/mL的混合对照品储备液。精密称取染料木素适量,用色谱甲醇配成0.901 mg/mL内标储备液。


2.3.4  血浆样品处理  精密吸取血浆样品100 pL,加入染料木素内标储备液10 uL、0.5 mol/L HCI溶液50 uL,涡旋振荡混匀,加入醋酸乙酯1 mL,振荡液-液萃取10 min,4 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液,用氮吹仪吹干(40 C),最后用2 mL流动相(1:l) 涡旋复溶,0.22 um微孔滤膜滤过后进样10uL。


2.3.5 专属性考察 分别取大鼠空白血浆,加入黄芩苷、黄芩素和内标染料木素对照品的空白血浆和实验组的含药血浆样品,按“2.3.4”项方法处理后进样。结果见图1。本实验条件下,血浆中的内源性物质不干扰黄芩苷、黄芩素和内标物的测定,表明方法专属性良好,  黄芩苷、黄芩素和内标物的保留时间分别为4.71、5.66、6.01 min。


2.3.6  线性关系考察  分别取空白血浆100pL,加入10 uL混合对照品系列溶液,配成黄芩苷质量浓度为4.220、2.110、1.055、0.528、0.264、0.132、0.066、0.013 ug/mL 和黄芩素质量浓度为5.120、2.560、1.280、0.640、0.320、0.160、0.080.0.016 ug/mL系列对照品溶液,按“2.3.4”项方法处理并测定,记录黄芩苷、黄芩素与内标物的峰面积。以黄芩苷(黄芩素)质量浓度为横坐标(X),黄芩苷(黄芩素)与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y),用加权(W=1/x?)最小二乘法进行线性回归,得回归方程,黄芩苷: Y=0.0669 X-0.0117,(R=0.9996),黄芩素:Y=0.0322X+0.0527 (R=0.993 3),黄芩苷在0.013~4.22 ug/mL 线性良好,黄芩素在0.016~5.12 ug/mL线性良好;黄芩苷和黄芩素的定量下限分别为0.013、0.016 ug/mL。


2.3.7 提取回收率 在空白血浆中加入已知量的黄芩苷、黄芩素对照品,制成黄芩苷高、中、低质量浓度(4220、264、13 ng/mL)和黄芩素高、中、低质量浓度(5 116、326、16 ng/mL)的质控(QC)样品,每个质量浓度样品制备6份,按“2.3.4”项方法进行样品处理后,依法测定。另取空白血浆样品,按“2.3.4”项方法进行样品处理,离心后得上清液,分别加入与上述相应质量浓度的对照品溶液,离心后吹千,残留物用2 mL流动相复溶,处理后依法测定。以2种方法测得的黄芩苷、黄芩素峰面积比值计算提取回收率,测得高、中、低质量浓度黄芩苷的提取回收率分别为87.8%、93.5%、90.4%,高、中、低质量浓度黄芩素的提取回收率分别为89.1%、91.8%、94.9%,均在85%~115%,符合实验要求。


2.3.8 精密度与准确度、稳定性考察  按“2.3.7”项方法制备3个不同质量浓度的QC样品,按“2.3.4”项方法处理后进样,考察日内与日间精密度;考察室温放置24h、-80 C反复冻融3次、-80。C保存20d、进样器放置24h后的稳定性。测得高、中、低质量浓度黄芩苷和黄芩素的日内精密度RSD分别为4.2%、6.1%、6.3%,5.7%、4.5%、7.8%;高、中、低质量浓度黄芩苷和黄芩素的日间精密度RSD分别为7.4%、8.2%、10.7%,6.2%、7.9%、11.4%,均低于15%,符合要求;准确度以误差(RE)表示均低于15%;室温放置24h、-80 C反复冻融3次、-80 "C 下保存20d、进样器放置24h后黄芩苷和黄芩素的准确度以RE表示均低于15%, RSD低于15%,符合要求。


2.3.9 基质效应考察 通过对比萃取后空白血浆与等浓度流动相中的黄芩苷(黄芩素)与内标的峰面积来评价基质效应。分别取空白血浆100 puL, 按*2.3.7”项下方法操作,采用处理后加入待测样品及内标的方法,配制低、中、高3个质量浓度的黄芩苷(黄芩素)样品,此法获得的峰面积记为A,每-一质量浓度平行制备6个样品。低、中、高3个质量浓度的黄芩苷(黄芩素)对照品溶液直接进样后获得的峰面积记为B,每一质量浓度平行制备 3个样品。A/B的值即为基质效应。结果显示:黄芩苷低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为88.17%、91.24%、91.12%; RSD分别为4.2%、4.8%、2.0%;黄芩素低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为87.62%、90.76%、92.15%; RSD分别为3.8%、4.2%、2.3%。结果表明本研究所确立的样品处理检测方法基质效应较小,对检测目标物质具有特异性和针对性,血浆中的内源性物质不影响目标物质的检测。


2.4  统计学处理 采用药动学计算程序DAS 3.2.2 对大鼠血浆中黄芩苷(黄芩素)的相关数据进行处理,并用非房室模型进行药动学参数计算;采用SPSS 18.0 统计软件对所得参数进行统计学分析,比较各组间的差异,实验数据以x士s表示。


2.5  药动学结果及分析  各组大鼠血浆中的黄芩苷药时曲线见图2,黄芩苷的药动学参数见表3。


2.5.1 大鼠ig黄芩苷后的药动学特征  由图2结果可知,菌群失调大鼠和正常大鼠ig黄芩苷后,黄芩苷的药时曲线均出现多峰现象,在给药后1 h血药浓度达到第一个峰,在7~10 h黄芩苷血药浓度最高,其原因可能是黄芩苷在体内各部分(如胃、肠等部位)的吸收速度与程度不同,可能存在肝肠循环或其他循环。菌群失调大鼠ig黄芩苷后,体内黄芩苷的药时曲线低于正常大鼠的黄芩苷的药时曲线,达峰时间(tmax) 也有所延迟,表明抗生素诱导肠道菌群失调后,影响了黄芩苷的吸收。由表3可知,抗生素十黄芩苷组血浆中黄芩苷的CmxAUCor分别为(7.80土5.52) mg/L、(32.60土18.88) h-mg/L显著低于黄芩苷组的Cmax [(16.35士9.48) mg/L]和AUCo~r[(75.16士48.40) h-mg/L] (P<0.05),V2/F、CL/F均显著高于黄芩苷组,tmax、 t12高于黄芩苷组(P<0.05),表明肠道菌群失调增加了黄芩苷在体内的分布,加快了黄芩苷的消除速度,减缓了黄芩苷的吸收速度,最终抑制了黄芩苷的吸收程度;结果提示,肠道菌群失调抑制黄芩苷在大鼠体内的吸收。


2.5.2 大鼠ig黄芩素后的药动学特征 在本实验的给药剂量下,ig给药黄芩素后,黄芩素原型药完全被代谢,在大鼠血浆中主要检测到代谢产物黄芩苷,因此对血浆样品中的黄芩苷进行定量,这与文献报道一致"7]。有图2和表3可知,正常大鼠ig黄芩素后,血浆中黄芩苷在2 h达血药浓度高峰,提示黄芩素迅速被吸收;等摩尔剂量下,正常大鼠体内,黄芩素组的黄芩苷的Cmax 和AUCa;均显著高于黄芩苷组,V,/F、 CL/F均显著低于黄芩苷组,tmax显著短于黄芩苷组,这可能是ig黄芩素后,黄芩素迅速被吸收进入血液循环,黄芩素在体内分布减少,清除率降低,造成黄芩素组最终Cmax 和AUCo-1显著增加(P<0.05)。给药黄芩素后,相比于正常大鼠,抗生素处理大鼠体内黄芩苷的  Cmax、AUCo显著降低(P<0.05),V2/F、CL/F均显著升高(P<0.05),tmax、tr显著升高(P<0.05), 提示肠道菌群失调,黄芩素的吸收程度降低了,在体内的分布增加了,清除率提高,吸收速度减缓了;肠道菌群失调抑制黄芩素在大鼠体内的吸收过程。


讨论 几乎所有的抗生素均能引起肠道菌群失调。林可霉素、头孢类、其他青霉素类、氯霉素、大环内酯类、 四环素类等抗生素均能诱导使肠道菌群紊乱[18-19]。其中,头孢类和盐酸林可霉素能在较短时间内诱导肠道菌群失调,停药后失调状态维持较长时间,其中盐酸林可霉素所致肠道菌群失调维持时间最长1819]。因此,本实验采用盐酸林可霉素诱导大鼠肠道菌群失调,无菌采集盲d肠内容物,通过麦康凯培养基、肠球菌琼脂培养基、双歧杆菌培养基、乳酸杆菌琼脂培养基,平板计数琼脂选择培养,分别对大肠埃希菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌与总菌群数量变化进行了测定。结果表明,与对照组比较,抗生素组大鼠的大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌与总菌群均减少,其存在显著性差异(P<0.05), 提示抗生素组大鼠的肠道菌群紊乱。造模期间可观察到抗生素组大鼠相对于正常大鼠毛色粗糙,粪便稀湿,出现较为严重的腹泻症状,结合肠道菌群检测结果,提示抗生素诱导肠道菌群失调成功。大鼠ig黄芩苷后,抗生素+黄芩苷组黄芩苷的吸收显著低于黄芩苷组,推测抗生素诱导肠道菌群失调后,抑制了黄芩苷在大鼠体内的吸收。大鼠ig黄芩素后,主要检测到代谢产物黄芩苷,原形药黄芩素低于检测限,因此对血浆样品中的黄芩苷进行定量[17]。口服黄芩素后,黄芩苷在2h达血药浓度高峰,提示黄芩素迅速被吸收;等摩尔剂量下,给药黄芩素组的黄芩苷的Cmax 和AUCo-1均显著高于黄芩苷组,这可能是由于口服黄芩素会被直接吸收,而口服黄芩苷,则需要微生物水解转化为黄芩素后再被吸收,因此前者吸收黄芩素的药量明显高于后者,最终导致达峰浓度的增加[20]。本实验分别给予抗生素大鼠和正常大鼠等摩尔浓度的黄芩素,结果,抗生素组黄芩苷的吸收显著低于正常组,推测抗生素诱导肠道菌群失调后,抑制了黄芩素在大鼠体内的吸收。


本实验研究并比较黄芩苷和黄芩素在抗生素诱导菌群失调大鼠和正常大鼠体内的药动学行为的差异,发现抗生素盐酸林克霉素可导致大鼠肠道菌群失调,进而抑制黄芩苷和黄芩素的吸收。本研究证实了抗生素类药物由于其导致肠道菌群失调,减少了黄芩苷和黄芩素的吸收,降低了其药理作用,因此临床上将这类抗生素药物与含黄芩苷、黄芩素药物合用的科学性有待商榷。


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